CRISPR細胞株構築

ゲノム編集を簡単に

概要

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)は元々、大腸菌ゲノムから同定され、DNAレベルで標的の外来遺伝子を破壊する、RNAベースの獲得免疫系の一部の機能として見つかったものです。CRISPR関連タンパク質（Cas）は外来DNAを切断するエンドヌクレアーゼで、宿主ゲノムへの取込みを可能にしています。この切断機能は侵入した外来DNAのターゲット配列周辺に「protospacer adjacent motif」（PAM）がある時にのみ生じ、高精度なターゲッティングを可能にします。 CRISPRの研究者はこの機構を応用し、ターゲット宿主ゲノムの遺伝子編集用のツールとして開発しました。CRISPR/Cas9は近年、その簡便さと汎用性から、人気のゲノム編集ツールとなっています。

ハイライト

ONE STOP SOLUTION

デザインから機能評価まで対応

STAY UPDATED

専門チームで対応

TRACK RECORD

100種類以上の細胞株での成功実績

CRISPRゲノム編集サービス

ワークフロー

宿主細胞株の評価：gRNAデザインおよび合成

クローン化試験
トランスフェクション最適化
プロモーター最適化

細胞株構築

RNPベースのデリバリー
サンガーシークエンシング
FACSとウェスタンブロット

スクリーニングと検証

ハイスループットスクリーニング
二重の確認
複数の陽性クローン

クローンの凍結保存とQC

セルバンキング
細胞生存率およびマイコプラズマ試験
CoAレポート

サービス仕様

サービス名	サービス詳細	細胞株オプション	納品物	納期（輸送期間は含んでいません）
GenCRISPR™ EZノックアウトサービス	単一遺伝子ノックアウト細胞プール／シングル細胞株複数遺伝子ノックアウト細胞プール／シングル細胞株	90以上のよく使用されるトランスフェクションに最適な細胞株を利用可能，A549、CHO-K1、HT-29、MDA-MB-231、4T1、A20、HCT116、MCF7、MDCK、U937、RPMI 8866など	One knockout cell pool/two full-allelic knockout cell lines validated by sequencing One negative control cell pool transfected with non-targeting gRNA Biweekly project updates	3-6 週間（細胞プール） 9-15 週間（細胞クローン）
GenCRISPR™カスタムノックアウトサービス	単一遺伝子ノックアウト細胞プール／シングル細胞株複数遺伝子ノックアウト細胞プール／シングル細胞株			8-11 週間（細胞プール） 16-24 週間（細胞クローン）
GenCRISPR™カスタムノックインサービス	点変異シームレスな点変異内在性遺伝子座／遺伝子タグ付け／レポーター変異研究のための細胞モデル（SNV、SV、インデル、その他を含む） GOIのセーフハーバー挿入	細胞株の種類は問いません	1-2 knock in cell lines validated by sequencing One negative control cell pool transfected with non-targeting gRNA Biweekly project updates	12-25 週間（細胞クローン）
GenCRISPR™全遺伝子欠損サービス	全遺伝子欠損	Any cell line	シークエンシングで検証した、1種類のノックアウト細胞プール／2種類の全アレルノックアウト細胞株非ターゲティングgRNAでトランスフェクションした、1種類のネガティブコントロール細胞プール隔週ごとのプロジェクトアップデート	13-23 週間（細胞クローン）

弊社でご希望の細胞株を所有していない場合、お客様の細胞株をご提供頂く形が望ましいですが、市販されている細胞株をGenScriptで購入させていただくことも可能です。（追加料金が必要になります）現在、プライマリー細胞、幹細胞やiPS細胞のゲノム編集サービスは提供しておりません。
CRISPR細胞株の検証サービスは、以下の”追加サービス”からご覧いただけます。

追加サービス

追加サービス	説明
逆転写（RT）-PCR	陽性細胞プール／クローンのmRNAレベルでの検証
フローサイトメトリー解析	導入遺伝子発現を、フローサイトメトリー解析で検証。ターゲットタンパク質またはレポータータグへ特異的に結合する、検証済抗体をご提供いただく必要がございます。
ウェスタンブロット	ウェスタンブロットによる陽性クローン検証。宿主細胞でターゲットタンパク質へ特異的に結合する、検証済抗体をご提供いただく必要がございます。
発現安定性試験	15/20世代の目的遺伝子発現安定性をウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーにより検証します。
納品用クローン追加	追加納品用陽性クローンのＱＣと出荷用調製を行います。
オフターゲット解析	上位5つの潜在的なオフターゲット部位をシークエンシング解析で、1種類のノックアウトクローンを評価します。

事例集

事例1
- 図1のターゲティング戦略に示した通り、ヒト大腸癌細胞株HCT116のK-ras座位を、エクソン4にインデルを作ることでノックアウトした（Fig. 1）。
- Cas9および gRNA デリバリ用にパッケージングされたウイルスのタイターを、HCT116細胞用に最適化した。
- 各クローンについてエクソン4のK-rasのホモ接合ノックアウトインデルを確認しセレクションするためにサンガーシークエンスを実施した。サンガーシークエンシングデータ（Fig. 2）。
- ウェスタンブロットにより、セレクションしたクローンのK-ras発現の欠損を確認した（Fig. 3）。
事例2
- GSアレルの特定領域をターゲットするため、シークエンス最適済みgRNAをデザイン・合成した。DG44細胞にコンストラクトをトランスフェクションし、細胞プールをサンガーシークエンシングで解析した。
- 取得できたシングルクローンについてサンガーシークエンシングで解析した。フレームシフト変異を含むシングルクローンが確認された（Fig. 1）。
- GSノックアウトクローンについてはタンパクレベルでのGSタンパク発現解析も実施した（Fig. 2）。
- 機能的な欠損を確認するため、GSノックアウト細胞株をいくつかのグルタミンの濃度下で生育した（Fig. 3）。GSノックアウト細胞株はグルタミン非存在下では増殖できないことが確認された。一方、グルタミンが増加するに従い増殖能が改善した。これにより、GSノックアウト細胞株はその機能が欠損していることが確認された。
- 以上の結果から、GSのターゲティングに成功し、その発現とGS機能の完全な欠損が検証されたシングルクローンが取得された。
事例3

A

Validation of A gene KO by RT-PCR

B

Validation of B gene KO by WB

Double gene Knockout