Broad Instituteの事前検証済みCRISPR試薬遺伝子スクリーニング、ノックアウト、ノックイン、細胞株作製
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、その簡便さと汎用性の高さから多様な用途に応用されています。GenScriptは、MITおよびハーバード大学ブロード研究所(Broad Institute)のFeng Zhangらの研究室とのパートナーシップを通じて、CRISPRゲノム編集に関する製品、サービス、およびリソースを提供しています。
GenCRISPR™ サービスの概要について詳しくは CRISPR Brochureをご覧ください。
Dr. Theo Roth from Marson Lab, UCSF introduces the advantages of a new CRISPR based method that allows for the insertion of large DNA sequences (>1Kb) in primary T cells without a virus.
CRISPR RNP(ribonucleoprotein)を用いたゲノム編集のためのガイド
ライフサイエンス研究を変革するゲノム編集概論
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）と呼ばれている反復クラスターは、大腸菌で初めて特定された、細菌や古細菌がウイルス感染を防ぐために発達させた免疫システムです。CRISPR-associated protein (Cas)は外来DNAを切断し、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするエンドヌクレアーゼです。
CRISPR/Cas9システムは、DNA二本鎖を切断してゲノム配列の任意の場所で配列の削除、置換、挿入を行うことができるゲノム編集技術として利用されています。図のように、 このシステムは、guide RNAとCas9タンパク質の共発現を必要とします。Cas9タンパク質はターゲット配列に相補的なgRNA と複合体を形成してターゲット配列を認識し、PAM配列より上流の二本鎖DNAを切断します。切断されたゲノムDNAが修復・組換えされることを利用して、ノックアウトやノックインを行うことができます。 現在、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術は、ヒトやマウスといった哺乳類細胞のほかに、細菌やゼブラフィッシュなどの膨大な種類の細胞や生物種において、広く使われています。
CRISPRシステムは、ゲノム編集技術の中でも簡便性と効率の点で卓越しています。必要な成分はgRNAとCas9をコードする数種類のDNAだけで、ノックインする場合はHR（相同組換え）のためのドナーDNAテンプレートになります。このため、分子生物学が専門でない研究者でも使用できるゲノム編集技術です。以下の表は、ゲノム編集におけるCRISPRと他の一般的な技術との主な違いをまとめたものです。
Cas9ヌクレアーゼがターゲットDNA部位に誘導され、PAM配列から3-4塩基上流の二本鎖を切断します。二本鎖DNA切断（DSB）を修復する方法には2種類あります。ドナーDNA配列がない場合は非相同末端結合（NHEJ）用いられます。この方法ではエラーを生じ易く、その結果生じるインデルによりタンパク質機能が効果的にノックアウトされます。一方、ドナーDNA配列がある場合は相同組換え修復（HDR）によりDSBが修復されます。この方法では、ターゲット遺伝子が正確な位置にノックインされます。
Cas9とgRNAの細胞内導入の最も効果的な方法は、細胞の種類によって異なります。トランスフェクションが容易な細胞の場合は非ウイルス系で十分な導入効率を得られることが多く、リポフェクションで効率良く細胞内に導入することができます。プラスミドの場合は、薬剤耐性遺伝子や蛍光タンパク質など、トランスフェクション効率を確認するためのセレクションマーカーが通常組込まれています。トランスフェクションが困難な細胞に対しては、レンチウイルスがより適している可能性があります。弊社のレンチウイルスベクターは、第3世代および第4世代のレンチウイルスパッケージングシステムに適合しています。
詳細な実験計画については、Ranらの論文を参考にして下さい。
Ran et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 2013; 8:2281.
CRISPR/Cas9システムは、効率および特異性の点で最も優れたゲノム編集技術です。弊社では、gRNAシークエンスのデザイン経験で培われたゲノム編集技術を有しており、様々な種類の細胞系の遺伝子を高い効率でノックアウトすることが出来ます。CRISPRによるターゲティングの効率や特異性には以下の各要素が影響します。
弊社のgRNAクローンは、gRNAの発現およびゲノムDNAへの結合に必要なすべての要素（U6プロモーター、スペーサー（ターゲット）、Scaffold配列、ターミネーター）が含まれた、シークエンス検証済みの組換えプラスミドです。gRNAクローンについては配列を保証します。ただし、ゲノム編集された細胞株の作成にはトランスフェクションやセレクションなど複雑な作業が必要になるため、gRNAを使用した実験の結果につきましては保証の対象外となります。シークエンス検証済のCRISPRシステムによるノックアウトやノックイン細胞株をご希望の場合は、 GenCRISPR™ mammalian cell line serviceをご覧下さい。
詳細な情報はアーカイブの以下のwebinarをご覧下さい。
Webinar：Can CRISPR/Cas9 off-target genomic editing be avoided? Ways to improve target specificity.
CRISPR/Cas9によるゲノム編集には、gRNAとCas9ヌクレアーゼの2因子が必須です。実験を計画する過程において、これらを発現するために使用するベクターの選択は重要なステップです。多くの研究者は、gRNAとCas9を1：1の比率で発現するAll-in-oneベクターを使用しています。All-in-oneベクターには、蛍光タンパク質や薬剤耐性遺伝子などのセレクションマーカーが組み込まれており、それにより、期待通りのゲノム編集クローンを容易に分離することができます。gRNA対Cas9の発現比率の変更、gRNAプールのスクリーニング、あるいは大規模gRNAライブラリー使用などを行う場合は、別のベクターを用いてgRNAやCas9を個別に発現することも考えられます。
詳細情報は CRISPR gRNA construct service FAQをご覧下さい。
以下の手順は、HEK293細胞の使用に基づいています。HEK293以外の宿主細胞株を使用する場合、細胞培養、細胞の検定、トランスフェクション、およびサブクローニング等について、細胞のサプライヤーの指示に従うことを推奨します。このプロトコルを実験に適合させるにあたり、具体的な質問がある場合は、 online forum for Genome Engineering using CRISPR/Cas Systemsを参照することを推奨します。
哺乳動物細胞のコーディング配列をノックアウトするための実験概要：
宿主細胞（HEK293）を、最終濃度が10%になるように調製したウシ胎児血清を含むイーグル最少必須培地（Eagle's Minimum Essential Medium）で培養します。 37℃で培養を行います。 細胞濃度が6〜7 x 104 cells / cm2に達した場合、継代培養を行います。 トランスフェクションの1日前に、細胞培養プレートに4-6x104 cells / cm2の細胞を播種します。
HEK293への標準的トランスフェクション法により、gRNAとCas9をトランスフェクションします（複数の試薬をメーカー推奨の使用法に準拠することで高いトランスフェクション効率が得られます）。
CRISPR/Cas9システムの2因子に対するDNA量の比率
トランスフェクションの2～3日後には、サンガー法やNGSといった直接的方法やSurveyorアッセイなどにより、細胞プールを解析することができます。以下に、サンガー法とSurveyorアッセイ（またはT7E1アッセイ）による一般的な検証法を簡潔に示します。
短い塩基配列の挿入や欠損（インデル）による変異を導入する場合、ターゲット領域をサンガー法でシークエンシングすることにより、二本鎖切断（DSB）部位近傍に二重に重なる波形パターンを検出することができます。
Surveyorアッセイ（またはT7E1アッセイ）では、ミスマッチ特異的DNAエンドヌクレアーゼを使用して、ターゲット遺伝子座でのインデル変異を検出します。解析領域に存在するミスマッチ部位の数によりますが、ミスマッチのヘテロ二本鎖DNAを特異的に切断することで2本以上の短鎖DNA断片が産生されます。
これらのアッセイは、試薬製造元のプロトコールに従い使用して下さい。
トランスフェクションされた細胞は、Cas9発現プラスミドにより産生される薬剤耐性マーカーやGFPによりセレクションができます。*
トランスフェクション細胞は、96ウェルプレートにウェル当たり細胞1個を分注してクローニングします。あるいは宿主細胞株を希釈して10㎝ディッシュで培養し、24ウェルプレートに分注して保存しておくこともできます。
*抗生物質を含む培地を使用してセレクションをする場合、宿主ゲノムにCas9発現プラスミドがランダムに取りこまれる可能性があるので注意して下さい。
サンガーシークエンシングを行い、ターゲット領域に変異を有するクローンを同定します。小さなインデルが導入された二本鎖切断の修復部位では、シークエンシングのトレースファイル上で二重に重なる波形パターンが検出されます。
ノックアウト細胞株は、特異的抗体によるウェスタンブロッティングまたはターゲット遺伝子に特異的な機能アッセイにより確認することができます。