CRISPR技術を用いた遺伝子挿入、置換、修正

CRISPRを用いた相同組み換え修復でのゲノム編集

CRISPR / Cas9技術は、ターゲットDNA上で正確な二本鎖切断（DSB）を作成するために広く使用されています。ガイドRNA（gRNA）は、Cas9と複合体を形成した後、ターゲットDNA上のPAM配列を認識し、Cas9はそのエンドヌクレアーゼ機能によりDSBを引き起こします。これにより、2つの修復メカニズムが起こります。1つは非相同末端結合（NHEJ）であり、DSBサイトに変異を導入します。もう1つのメカニズムは、相同組み換え修復（HDR）で、これによりドナーDNAを切断部位に挿入し、遺伝子ノックインを作成することが可能です。

HDRの際のドナーDNAとしてはこれまでに二本鎖のものがテンプレートとして使用されていましたが、最近の研究では、一本鎖DNA（ssDNAまたはssODN）がCRISPRによる遺伝子挿入、置換、および修正に最適であることがわかってきました1-5。二本鎖DNAと比較した場合、ssDNAは、特に初代培養細胞、幹細胞の編集やおよびトランスジェニック動物モデルの開発において、編集効率と特異性が大幅に向上し、オフターゲットが減少することがわかりました。

フライヤー:

• HDR Template Flyer

Case Studies:

• Long hybrid ssDNA HDR templates enable high yield non-viral cell therapy manufacturing
• High gene knock-in efficiency and reduced off target integration with single-stranded DNA HDR template
• Using Long ssDNA for the Generation of Foxi1-rtTA Transgenic Mice

ユーザーマニュアル:

• ssDNA User Manual

ウェブセミナー:

• CRISPR in Creating Knockin Cell Lines and Animal Models - Functionalizing Genome Editing for a Broad Range of Targets
• In vivo delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA with gold nanoparticles
• CRISPR Based T Cell Editing: Large knock-ins in human T cells using non-viral HDR templates
• Strategies to Efficiently Generate CRISPR KO/KI Cell Lines

関連文献:

二本鎖DNAと比較した場合、ssDNAは、特に初代培養細胞、幹細胞の編集やおよびトランスジェニック動物モデルの開発において、編集効率と特異性が大幅に向上し、オフターゲットが減少することがわかりました^1-5.

• "We recently demonstrated that long single-stranded DNAs (ssDNAs) serve as very efficient donors, both for insertion and for gene replacement." Miura H, et al., Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. (2018) 13(1):195-215.
• "We report that targeted chromosomal translocations are generated more efficiently when the all-in-one plasmid, RNP complex, and ssODN-based approaches are used, with the most efficient strategy being the combination of RNP complexes with translocation-ssODNs." Torres-Ruiz, et al., Efficient Recreation of t(11;22) EWSR1-FLI1+ in Human Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Stem Cell Reports. (2017) 8: 1408–1420.
• "ssDNA templates have a unique advantage in terms of repair specificity while dsDNA donors can lead to a high rate of off-target integration." Li, et al., Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in. bioRxiv 178905; doi: https://doi.org/10.1101/178905.
• "The PITCh approach required 265 zygotes whereas Easi-CRISPR used only 105 zygotes, and the PITCh approach produced 33% correctly targeted pups, whereas Easi-CRISPR (using ssDNA donors) produced 100% correctly targeted pups." Quadros, et al., Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology (2017) 18:92.
• "Similar to what has been described with viral HDR templates, we found evidence to suggest that double-stranded templates could integrate independent of target homology, albeit at low rates. These rare events could be reduced almost completely by using single-stranded DNA (ssDNA) templates." Roth, et al., Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559 (2018) 405–409.

• 1) CRISPRを用いたKIをする場合にHDRのテンプレートとしてどのようなものを選んだらよいのか？? Read More »

実験の目的と宿主細胞株に依存しますが、二本鎖DNAと比較した場合、ssDNAは、特に初代培養細胞、幹細胞の編集やおよびトランスジェニック動物モデルの開発において、編集効率と特異性が大幅に向上し、オフターゲットが減少することがわかりました。

	プラスミドDNA	二本鎖DNA	一本鎖DNA
HDR効率	Medium	High	Comparable to dsDNA
オフターゲット	Medium	High	Low
費用	Lower	Medium	High
毒性	High	High	Low

• 2) 効率的なssDNAテンプレートをデザインするコツはありますか？ Read More »

点変異については非対称ssDNAデザインを使用することをお勧めします。詳細はこちらの論文を参照してください。より大きな遺伝子の挿入に関してはこれまでに300-1,000 bpの相同性アームが機能することが知られており、また、多くの場合500 bp程度の長さが機能することが知られています。また、二次切断を回避するためにsgRNA PAM配列を変異させるようなサイレント変異を含むテンプレートを作成することも重要とされています。　設計の際にはソフトウェアを用いてデザインすることをお勧めします。

• 3) テンプレートの両側で推奨される相同性アームの長さはどのくらいですか？ Read More »

300-1,000 bpの相同性アームが機能することが知られており、特に500 bp程度の長さが効率よく機能するとされています。

• 4) CRISPRを用いたKIの効率を上げるコツはありますか？ Read More »

• sgRNAを注意深く設計します。sgRNAの切断部位は変異部位に隣接している必要があり、それぞれ15 bp以内であることが最適です
• gRNA/Cas9およびドナーとなるテンプレートのトランスフェクションの前にトランスフェクション効率を最適化しておきます
• トランスフェクションされた細胞を集めるためにFACSを使用してください
• 可能であれば薬物およびマーカーによるセレクションを用いてください。(例: 挿入遺伝子のC末端にセレクション用のピューロマイシン耐性遺伝子をタグ付け)
• さらに詳細については、こちらの弊社のウェブセミナーをご覧ください。

• 5) ノックインマウスを作製するコツはありますか？ Read More »

CRISPR/Cas9を用いた従来のKOマウスの作製は効率的にできますが、コンディショナルKO/KIマウスの作製は難しいとされています。

• HDRの効率はCas9による切断効率と高い相関性があるので、注意深くsgRNAを設計してください。
• 二本鎖DNAよりも長鎖の一本鎖DNAを使用してください。これによってオフターゲットが大幅に抑えられます。
• LoxPを用いてコンディショナルマウスを作製する場合には2本の短い一本鎖DNAを用いるよりは、長い一本鎖DNAを用いる方が効率が良いとされています。

• 6) トランスフェクションした細胞でHDRの効率が悪かった場合にはどのようにすればいいですか？ Read More »

問題解決のために、下記のワークフローを参照してください。



• 7) GenScriptで合成できるssDNAの最大長はどのくらいですか？ Read More »

GenScriptでは長さが3,000nt未満のシークエンスが日常的に合成されています、また、これまでに非常にGCの含有率の高い最大5,000ntのssDNAの合成にも成功しています。3,000nt以上のssDNAの合成をご希望の場合には弊社テクニカルサポート に連絡して見積もりを入手してください。

• 8) GenScriptで合成できるssDNAの最大量はどのくらいですか？ Read More »

GenScriptで提供できる最大量はは1kb未満の場合には40µg、1〜3kbの場合は20µg、3 kbを超える場合には5 µgです。

• 9) どのような品質管理テストが行われますか？ Read More »

凍結乾燥する前に、弊社では、最終的なssDNA合成品に対して2つの主なQC検査を実施します。1）ssDNAシーケンスの正確性を確認するためのサンガーシーケンス。 2）ゲル電気泳動によるssDNA産物の純度試験。

• 10) なぜ最終産物を含め2度のシークエンスを行うのですか？ Read More »

ssDNAの合成中、シークエンスの正確性を保証するために2度シークエンスを確認します。 最初に、シークエンスによって確認されたプラスミドDNAテンプレートを選択し、最終産物のssDNAの純度とシークエンスの精度を確保し、製品の均一性を確認します。

• 11) ssDNA製品をどのように精製しますか？ Read More »

磁気ビーズおよびアガロースゲルによる精製を組み合わせ、高純度で高収量そして化学汚染ゼロを保証しています。

• 12) ssDNAにｄｓDNAが混入する可能性について考えた方がいいですか？ Read More »

いいえ。合成されたssDNA製品は、完全長の配列確認済みのssDNA分子のみです。 GenScriptでは、独自の特許出願中の酵素を用いた合成アプローチにより、dsDNAの混入が検出できないレベルになっていることを保証しています。

• 13) COAのゲルの画像に複数バンドがみられるのはなぜですか？ Read More »

一部のssDNA製品は、ヌクレオチド配列の性質により、分子間/分子内の力による強い凝集性を示す場合があります。

ゲルの画像でみられる複数のバンドがssDNA凝集体であるか、dsDNAのコンタミネーション化を判断するためには、dsDNAではなくssDNAを分解するS1 Nucleaseを使用して消化テストを行います。 dsDNAがない場合には、すべてのサンプルをS1 Nucleaseで消化後、ゲル電気泳動を行うとバンドが観察されません。製品にdsDNAのコンタミネーションがある場合には、S1 Nucleaseにより消化を行った後も、バンドが残っていることとなります。



さらに、この余分なバンドがssDNA凝集体であるかどうかを確認するためには、ゲル上のssDNAバンドを切り取り、再度ゲル電気泳動を行うこととなります。凝集したssDNAの場合には、精製後も複数のバンドが認められ、ssDNAバンドに対するその他のバンドの比率は同じままです。