効率的スクリーニングに有用な、
ゲノムワイドのパスウェイ特異的gRNAライブラリー
CRISPR gRNAのプールライブラリーは、ターゲット分子のハイスループットスクリーニングに最適です。このライブラリーを使用することにより、CRISPRによるゲノム編集において、遺伝子発現や転写活性化因子のノックアウトを効率的かつ特異的に行うことができます。
弊社では、Broad Instituteによるシークエンス検証済の様々なgRNAライブラリーを揃えています。（1）ヒトおよびマウスのゲノムワイドのGeCKOライブラリー、（2）ヒトおよびマウスの各遺伝子の転写活性に関するCRISPR Synergistic Activation Mediator（SAM）ライブラリー、（3）特異的機能を有するパスウェイに関するgRNAライブラリー。
CRISPRによるスクリーニングは、簡便性、特異性、汎用性に優れていることから極めて有用です。ゲノムワイドのGeCKOやSAMのライブラリーは、ヒトおよびマウスの全遺伝子をターゲットとしており、各遺伝子をノックアウトあるいは転写活性化するものです。パスウェイに関するgRNAライブラリーは、Drug Gene Interaction Databaseにより同定されたターゲットをもとにデザインされており、スクリーニングをより簡便に行えるようアプリケーションに重点が置かれています。ライブラリーを増幅し、パッケージングにより宿主細胞にトランスフェクションすることにより、変異細胞株を作製することができます（図1）。変異した細胞を、ポジティブセレクションやネガティブセレクションなど特殊な条件下でスクリーニングすることにより、パスウェイにおける重要な遺伝子変異を特定することができます。
Figure 1: How to use CRISPR gRNA libraries
CRISPRによる全ゲノムのノックアウト（GeCKO）v2ライブラリーは、ヒトやマウスの細胞において、特定のフェノタイプの発生を欠失させる機能欠損変異の迅速なスクリーニングに有用です。弊社の8種類のGeCKO v2ライブラリーは、Broad Instituteからのライセンスに基き、すべてFeng Zhang研究室で開発されています。このライブラリーは、ヒトおよびマウスのゲノムDNAの遺伝子およびmiRNAをターゲットとする各種gRNAをプールしたものです。GeCKO v2ライブラリーにはコントロールとしてnon-targeting gRNAも含まれており、さらに高力価レンチウイルスを産生するために最適化されたレンチウイルスベクターを使用することで、初代培養細胞へのトランスフェクション効率を向上させています。GeCKOライブラリーは、ヒトやマウスの初代培養細胞、幹細胞、癌細胞、安定発現細胞株において使用されています。さらに、様々な条件下における細胞の生存に必須となる遺伝子や、癌細胞の薬物耐性機能の発現に関与する遺伝子の同定も可能です。GeCKOライブラリーのデザインや構築に関する詳細については以下の論文をご覧下さい。Sanjana N.E., Shalem O., Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi: 10.1038/nmeth.3047.
GeCKO v2ライブラリーはAとB が各1/2で構成されているライブラリーで、1遺伝子当たり3個のgRNAが含まれています。両ライブラリーにはコントロールとして1000個のnon-targeting sgRNAが含まれています。また、AライブラリーにはmiRNAをターゲットとするgRNA（4 sgRNAs/miRNA）も含まれています。全ライブラリーをカバーするために両者を同時に購入して頂くことは可能ですが、その場合はより多くの細胞は必要になるため、最初はAライブラリーでのスクリーニングをお奨めします。
63,383 sequences:
58,028 sequences:
67,405 sequences:
弊社のgRNAライブラリーはIndustrialグレードで、特に記載がない場合は在庫出荷で納期は通常5～7日間です。量を増やすこともできますが、その場合は納期が延びることがあります。ライブラリーに関するお問い合わせは弊社までご連絡下さい。
GeCKOライブラリーは、ゲノムの各遺伝子とmiRNAをターゲットとする各種CRISPR gRNAをプールしたものです。各gRNAはレンチウイルスベクターにクローニングされ、レンチウイルスによる初代培養細胞や培養細胞株へのトランスフェクション効率が最適化されています。Read More »
GeCKOライブラリープールのトランスフェクションが細胞集団当たり1 x gRNAを超えないように、低値のMOIで細胞導入することが必要です。導入後、スクリーニングを行う前にNGSによるディープシークエンシングを実施し、内在性ゲノムにgRNAシークエンスが組込まれていることを確認する必要があります。スクリーニング終了時に再度NGSシークエンシングを行い、スクリーニング工程中でロスト、またはエンリッチメントされたgRNAを確認して下さい。GeCKOライブラリーによるスクリーニングで得られたトランスフェクション細胞が真のポジティブヒットであることを実証するには、複数のgRNAがエンリッチメントされていることを確認する必要があります。
SAMは、ゲノムの各コーディング領域の転写機能を強力かつ特異的に活性化します。SAMライブラリーを使用することにより、機能獲得したヒト遺伝子をスクリーニングすることができます。CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator（SAM）は、内在性遺伝子の転写機能を強力に活性化するように設計されたタンパク質複合体です。SAMは、gRNAによりゲノム上の特定のローカスを得意的にターゲティングすることができます。SAM複合体にはVP64、P65、HSF1各因子の３つの転写活性化ドメインが含まれており、転写開始位置から上流200bp以内のどの位置でもターゲットとし、3因子の作用により転写を増強します。SAMシステムでは切断活性を無くしたCas9が使用されており、内在性ゲノムのDNA鎖が切断されないことを確認しています。
ヒトのゲノムワイドSAMライブラリーは、RefSeqデータベース（23,430種のアイソフォーム）にある既知のコーディングアイソフォームすべてを活性化することができるため、遺伝子の活性化による機能獲得スクリーニングに有用です。このライブラリーは、ヒトおよびマウスの初代培養細胞、幹細胞、癌細胞、安定型発現細胞におけるスクリーニングに使用されています。SAMライブラリーを使用することにより、様々な条件下で細胞の生存に必須となる遺伝子や、癌細胞において薬剤耐性能を生じる遺伝子などを同定することが可能です。
SAMライブラリーのデザインや構築に関する詳細は、以下の論文をご覧下さい。Konermann S*, Brigham MD*, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O & Zhang F. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, doi:10.1038/nature14136.
すべてのSAMライブラリーはIndustrialグレードで、在庫品です（通常納期：5～7日間）。発注量を増やすことはできますが、納期が長くなる可能性があります。ライブラリー製品についてのお問い合わせは弊社までご連絡下さい。
SAMライブラリーは、ゲノムの転写開始点に隣接する上流域をターゲットとする各種CRISPR gRNAをプールしたものです。SAMによる機能獲得遺伝子のスクリーニングには、ヒトのゲノムワイドSAM sgRNAライブラリーの他に、2種類（dCas9-VP64およびMS2-P-HSF1）のSAM複合体を組み合わせて使用する必要があります。 Read More »
詳細細胞に3種類のSAM成分すべてが導入される必要があります。これらの同時細胞導入とトランスフェクション細胞の選択を可能にするために、3種類のレンチウイルスベクターにはユニークな薬剤耐性マーカー遺伝子が組込まれています。また、レンチウイルスは高力価になるよう最適化されており、SAMの3成分が初代培養細胞や培養細胞へ効率良く導入されます。SAMライブラリープールの細胞導入は低値のMOI（Multiplicity of Infection）で行い、細胞当たり1 x gRNAを超えないようにすることが必要です。トランスフェクション後、スクリーニングを開始する前にNGSによるディープシークエンシングを行い、細胞の内在性ゲノムにgRNAが組込まれたことを確認します。さらに、スクリーニング終了時に再度NGSを行い、シークエンスを解析することによりスクリーニング工程でロストあるいはエンリッチメントしたgRNAを特定します。ライブラリーによるスクリーニングで得られたトランスフェクション細胞が真のポジティブヒットであることを実証するには、複数のgRNAがエンリッチメントされていることを確認する必要があります。SAMスクリーニングの詳細はSAM / Genome Engineeringをご覧下さい。
SAMライブラリーは3成分で構成されています。
異なる3つの活性化ドメイン、Vp64、p65、HSF1、が複合体として機能することにより、強力な転写活性を生じます。以下に示す通り、これらのドメインはレンチウイルスベクター内の離れた位置にコードされています。SAMが活性化されるには、これらの3成分が同時に細胞導入される必要があります。ヒトゲノムワイドのすべてのSAM gRNAライブラリーについては.csv fileをご覧下さい。
パスウェイCRISPR gRNAライブラリーのプールは、パスウェイに関する重要な遺伝子のターゲットスクリーニングに最適です。Drug Gene Interactionデータベースからターゲット遺伝子を同定しデザインされたライブラリーで、パスウェイや疾患に関連する遺伝子すべてを対象にスクリーニングすることができます。すべてのgRNAシークエンスはBroad Instituteによりデザインされ検証済で、pLentiCRISPR v2ベクター内にクローニングされています。ライブラリーはIndustrialグレードで、レンチウイルスによるパッケージングが可能な状態で提供しています。このライブラリーがカバーするgRNAシークエンスの詳細はライブラリーハイパーリンクをご覧下さい。
パスウェイに関するライブラリーはIndustrialグレードで、カタログ製品です。
カタログ品のライブラリーの他に、以下のパスウェイ関連ライブラリーを調製することができます（納期3～4週間）。すべての遺伝子リストはリンクをご覧下さい。
*プールライブラリーは最少容量25 μgで、100 μgまで調製可能です。