Cas9 / Cas12a / Cas13aヌクレアーゼ

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事例集

• プライマリーT細胞での高いノックアウト効率（Cat. No. Z03623、Z03624）
  

  図1：basic GMPおよび研究グレードGenCRISPR™ Ultra Cas9または GenCRISPR™ Ultra eSpCas9を使用し、エレクトロポレーションによりプライマリーT細胞のTRACをノックアウト

  GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-basic GMP（Cat. No. Z03623）またはGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-basic GMP（Cat. No. Z03624）と、sgRNA（GenScriptのCRISPRsgRNA合成サービスで作製）をエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクションし、ヒトTRAC遺伝子をノックアウトした。トランスフェクションおよび細胞培養後、TRACノックアウト効率をフローサイトメトリーで測定した。basic GMPグレードGenCRISPR™ Ultra Cas9およびGenCRISPR™ Ultra eSpCas9のいずれにおいても、プライマリーT細胞で一貫して高いノックアウト効率を示した。

  注: No Cargo：Cas9タンパク質を添加していない群（ネガティブコントロール）
  No EP：トランスフェクション時にエレクトロポレーションを行っていない群（ネガティブコントロール）
  D3：3日後のノックアウト効率
  D6：6日後のノックアウト効率
  

  Cell Type:	Primary T cells
  Transfection Method:	Lonza 4D-Nucleofector® Transfection System
  Target Gene:	TRAC
  Cell amount:	1.0 x 106 cells
  Cas9:sgRNA ratio:	1:2 (25 pmol : 50 pmol)
  Cas9 Nucleases:	Z03623 GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMP Z03624 GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-basic GMP

• プライマリーT細胞での高いノックイン効率（Cat. No. Z03623-GMP、Z03624-GMP）
  

  図2：GMP グレードGenCRISPR™ Ultra Cas9またはGenCRISPR™ Ultra eSpCas9を使用して、エレクトロポレーションによりプライマリーT細胞のTRAC部位へGFP遺伝子をノックイン

  GMPグレードGenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP（Cat. No. Z03623-GMP）またはGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP（Cat. No. Z03624-GMP）と、sgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）、dsDNA HDRテンプレート（GenScriptのHDRテンプレート合成サービスで作製）を、エレクトロポレーションでトランスフェクションし、細胞培養後、遺伝子ノックイン効率をフローサイトメトリーで解析した。GenScriptのGenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP（Cat. No. Z03623-GMP）およびGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP（Cat. No. Z03624-GMP）のいずれにおいても、プライマリーT細胞における高いノックイン効率が確認された。

  Cell Type:	Primary T cells
  Transfection Method:	Lonza 4D-Nucleofector® Transfection System
  Target Gene:	TRAC
  Cell amount:	1.0 x 106 cells
  Cas9:sgRNA ratio:	1:2 (25 pmol : 50 pmol)
  HDR donor:	2 μg
  Cas9 Nucleases:	Z03623-GMP GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-GMP Z03624-GMP GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP

• プライマリーT細胞での高いノックイン効率（Cat. No. Z03701、Z03702）
  

  図3：GenCRISPR™ Cas9 v1.1またはGenCRISPR™ Cas9 v1.2とsgRNAを使用した、エレクトロポレーションによるプライマリーT細胞のTRAC座位へGFP遺伝子をノックイン

  GenCRISPR™ Cas9 v1.1（Cat. No.　Z03701）またはGenCRISPR™ Cas9 v1.2 （Cat. No.　Z03702）とsgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）、dsDNA HDRテンプレート（GenScriptのHDRテンプレート合成サービスで作製）を、エレクトロポレーションでトランスフェクションし、細胞培養後、遺伝子ノックイン効率をフローサイトメトリーで解析した。最適化された核局在配列（NLSs）を持つGenCRISPR™ Cas9 v1.1およびGenCRISPR™ Cas9 v1.2の両方で、高い遺伝子ノックイン効率が示された。

  Cell Type:	Primary T cells
  Transfection Method:	Lonza 4D-Nucleofector® Transfection System
  Target Gene:	TRAC
  Gene Knocked-in:	GFP
  Cell amount：	1.0 x 106 cells
  Cas9:sgRNA ratio:	1:2 (25 pmol : 50 pmol)
  Nucleases:	Z03701 GenCRISPR™ Cas9 v1.1 Z03702 GenCRISPR™ Cas9 v1.2

• Jurkat細胞での高いノックアウト効率（Cat. No.　Z03623-GMP、Z03624-GMP）
  

  図4：GMP Grade GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-GMPまたはUltra eSpCas9-2NLS GMPをJurkat細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクションし、CIITA、GM-CSFおよびTGFBR2をノックアウト

  GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP（Cat. No.　Z03623-GMP）、またはGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP （Cat. No.　Z03624-GMP）もしくは他社製品と、sgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）を、エレクトロポレーションでトランスフェクションし、ヒトCIITA、GM-CSF、TGFBR2遺伝子をノックアウトした。細胞培養後、遺伝子編集効率をサンガーシークエンシングで解析した。Jurkat細胞においてGMP Grade GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9および GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLSのいずれにおいても、高いノックアウト効率を示した。

  Cell Type:	Jurkat cells
  Transfection Method:	Neon™ electroporation system
  Target Gene:	CIITA, GM-CSF, TGFBR2
  Cell amount：	0.5 x 106 cells
  Cas9:sgRNA ratio:	1:3 (7.5 pmol: 22.5 pmol)
  Cas9 Nucleases:	Z03623-GMP GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-GMP Z03624-GMP GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP

• NK-92細胞での高いノックアウト効率（Cat. No.　Z03623）
  

  図5： GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMPをエレクトロポレーションでNK-92細胞のCD96およびNKG2Aをノックアウト

  NK-92に、GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMP （Cat. No.　Z03623）およびsgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）を、エレクトロポレーションでトランスフェクションし、CD96またはNKG2A遺伝子ノックアウトを行った。細胞培養後、遺伝子編集効率をサンガーシークエンシングで解析した。 GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMP （Z03623）の、NK-92細胞においていずれの遺伝子についても、高いノックアウト効率が示された。

  Cell Type:	NK-92 cells
  Transfection Method:	Lonza 4D-Nucleofector® Transfection System
  Target Gene:	CD96 , NKG2A
  Cell amount：	0.4 x 106 cells
  Cas9:sgRNA ratio:	1:1.2
  RNP amount:	80 pmol
  Cas9 Nucleases:	Z03623 GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMP

• 293T細胞での遺伝子編集における低いオフターゲット効果（Cat. No.　Z03623 、Z03624)
  

  図6：GenCRIPSR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMPまたはGenCRIPSR™ Ultra eSpCas9-2NLS-basic GMPとsgRNAを使用し、エレクトロポレーションによる293T細胞のTRAC遺伝子ノックアウト。A) TRAC遺伝子ノックアウト効率の解析　B) OT1部位のオフターゲット効果解析　C)OT2部位のオフターゲット効果解析

  GenCRIPSR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMP、GenCRIPSR™ Ultra eSpCas9-2NLS-basic GMP、または他社製品をそれぞれ個別に、sgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）とエレクトロポレーションによりトランスフェクションし、TRAC遺伝子のノックアウトを行った。OT1およびOT2はオフターゲット部位として想定されており、オフターゲット効果解析に用いた。トランスフェクションおよび細胞培養後、ノックアウト効率とオフターゲット効果を、サンガーシークエンシングで解析した。basic GMP Grade GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLSによる遺伝子編集は、低いオフターゲット効果を示し確かなオンターゲット編集効率であることが確認された。

  Cell Type:	293T cells
  Transfection Method:	Neon™ electroporation Transfection System
  Target Gene:	TRAC
  Cell amount：	0.2 x 106 cells
  Cas9:sgRNA ratio:	1:3
  Cas9 Nucleases:	Z03623 GenCRIPSR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMP Z03624 GenCRIPSR™ Ultra eSpCas9-2NLS-basic GMP

リソース

CRISPR RNP User Manual

GenScriptのRNP製品の使用方法マニュアル。

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CRISPR RNP Handbook

ライフサイエンス研究におけるRNPを介したCRISPR遺伝子編集と形質転換に関するハンドブック

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Cas9 and sgRNA Protocol

GenCRISPR™ Cas9 nucleaseを使用した、CRISPR遺伝子編集のシンプルなプロトコル

無料ダウンロード 

GenCRISPR gRNA Design Tool

インタラクティブなCRISPRガイドRNAデザインツール

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GenCRISPR™ Gene Editing Solutions

CRISPR遺伝子編集プロジェクトの成功に必要な全てのソリューション

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