お客様のプロジェクトのニーズを満たすためのフレキシブルな環状RNA合成サービス
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eGFPまたはF-Luciferaseを発現するカタログmRNAをお試しください！ 詳細はこちら >>
お客様のORF配列をお送りください
T7プロモーター、PIE、IRESおよびORFを含む、オーダーごとのcircRNA発現ベクターをデザインします(ご希望のIRES配列に変更可能)
遺伝子合成～プラスミド調製
当社の統合されたワークフローは、お客様のcircRNAを生産するための全ての要件に対応
研究用グレードIVT生産
高度な精製（RP-HPLC）およびQCオプションを含む、µgからmgまでの研究グレードカスタム環状RNA合成サービス
| QC | Item | Test Method | Specification | RUO Default |
RUO Upgrade |
|---|---|---|---|---|---|
| Identification | Appearance | Visual Inspect | Clear and free of foreign particles | ||
| RNA Length | Agarose Gel Electrophoresis | Expected size band detected | |||
| Identification | RNaseR degradation test | Not be degraded by RNaseR | |||
| RNA Content | UV Absorbance | Target ± 5% | |||
| PH | pH meter | Target ± 0.5 | |||
| Buffer Specification | Client Spec | N/A | |||
| Purity | A 260/280 Ratio | UV Spec | 1.70 ~ 2.30 | ||
| Purity by HPLC | HPLC | ≥80 % | |||
| Impurity | Total protein residue | Nano Orange Assay | ≤ 1% | ||
| Plasmid DNA Residue | qPCR | ≤ 0.1% | |||
| Safety | Endotoxin | Semiquantitative | < 10EU/mg | ||
| Endotoxin | Quantitative | < 10EU/mg | |||
| Bioburden | Sdirect Inoculation | No Growth after 48 hrs |
RT-PCRによるRNAコピー数
蛍光強度によるRNA発現レベル
環状eGFP-RNA（非修飾）および直鎖状eGFP-mRNA（100% N1-me-pseUで修飾）を、A549細胞に等モル量でトランスフェクションした。コーディングRNAの存在量をqPCRで測定し、GFP強度をフローサイトメトリーで測定した。その結果、環状RNAは直鎖状IVT mRNAと比べて安定性が高く、分解が遅いことが確認された。さらに環状RNAは、直鎖状IVT mRNAと比べてより高いタンパク質発現レベルと長い発現時間を示した。
ジェンスクリプトで合成した環状RNAは直鎖状mRNAよりもサイトカインレベルで低い免疫原性を示した。IL6の測定にはELISA法にはAbcamの ヒトIL-6 ELISA キット（ab46027）を用いた。INF-αおよびNF-κbの測定にはA549 dual cells（InvivoGen）に評価対象のmRNAをトランスフェクションし、細胞内のINF-αの発現はQUANTI-Luc/Gaussiaキットのプロトコルにに従い、ISG54の活性を相対発光試験によって検出した。NF-κbのレベルはQUANTI-Blueキットのプロトコルに従い、細胞培地のOD630nmで測定した。
ジェンスクリプトで合成した環状RNAは、直鎖状mRNAおよび公開されている方法で調製された環状RNAのいずれに比べ高い初期段階の発現および累積発現レベルを示した。A549細胞を環状RNAおよびeGFPをエンコードするmRNAでトランスフェクションした。環状RNAはジェンスクリプト独自の方法およびNat Commun 9, 2629 (2018)で公開されている方法を用いて調製した。トランスフェクション後6日までの蛍光を、フローサイトメトリーで解析（各時点で条件ごとに10,000個の細胞を解析）した。A549細胞の倍加時間＝22時間。
ジェンスクリプトのHPLC精製環状RNAは、未精製の環状RNAおよび公開された方法で調製された環状RNAのいずれよりも高い発現を示した。ジェンスクリプト独自の方法およびNat Commun 9, 2629 (2018)で公開されている方法を用いて調製したeGFPをエンコードする環状RNAを、細胞にトランスフェクションし、蛍光をフローサイトメトリーで解析した。
環状RNAの概要、ジェンスクリプトサービスの詳細、および直鎖状IVT mRNAと比較した安定性向上、長期発現、および免疫原性低減を示す事例集。
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『創薬研究への活用 , mRNA, AAV, プラスミド解析最前線』
環状RNA（circRNA）は、共有結合により閉じたループ構造を持つ一本鎖RNA分子の一種です。これらは様々な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしていることがわかっています。
直鎖状ｍRNAは5'および3'末端が両端に配置されており、通常5'CAP、5'UTR、3' UTRおよびpolyA tailで構成されています。一方環状RNAは5'と3'末端が結合し環状形態を形成しています。通常リボザイムをRNAコード領域に誘導するためにIRESを含むことが必要とされています。PIEを使用した環状RNAは最終的なRNA配列にエクソンとリンカーを含む"scar" 配列を持っています。
環状 RNA は、疾患診断用バイオマーカー、または治療法開発用の次世代 mRNA として期待されています。 医薬品開発ではさらなる検証が必要とされています。
IRES は内部リボソームエントリー部位であり、リボソームを動員して RNA からタンパク質への翻訳を開始します。 環状 RNA 開発のための IRES にはいくつかのオプションがあります。
GOI の最適な長さは 400 bp ～ 4 kb です。 circRNA の長さは合計で最大 5 kb。 より短いまたはより長い circRNA を合成する必要がある場合は、弊社までお問合せください。
当社では、環状RNA を精製するための独自の HPLC 精製プロセスを採用しています。
修飾された環状 RNA も可能です。詳細はお気軽にお問合せください。
はい、酵素ライゲーション法を使用して生成できます。
はい。
1mM クエン酸ナトリウム、TE pH7、RNase-Free H2O の 3 つのバッファーのオプションをご利用いただけます。 1mMクエン酸ナトリウムは、mRNAの安定性を高めるため、デフォルトの設定となります。
環状RNAの場合は最大 2mg/mL です。
主な理由は、環状化の追加工程があり、独自の HPLC 精製プロセスでは比較的長い時間がかかります。
直鎖状 mRNA に使用しているものと同じトランスフェクション方法を使用できます。 我々は、環状RNA においてリポフェクタミンと LNP が使用可能であると社内評価しています。
弊社グループのProBioを通じてcGMP mRNAを提供できます。 2023 年 9 月にサービスを導入して以来、GMP グレードの環状 RNA に関する当面の計画はまだありませんが、ご要望の際は弊社までお気軽にお問合せください。
