eSpCas9 mRNAおよびTRAC sgRNAを1:1の重量比で混合し、LP01-LNP 製剤（2.4 ugのRNA/LNP）あるいはリポフェクタミンによりHEK293T細胞へ導入した。トランスフェクション後3日目および5日目に細胞を溶解し、PCRおよびサンガーシークエンシングを行った。その結果、LNPでは97%の編集効率を示したが、リポフェクタミンでは61%であった。
ジェンスクリプトはmRNAおよび環状RNA (circRNA)用の脂質ナノ粒子（LNP）パッケージングサービスを提供しています。
LNPは、in vivoで容易に分解されるRNA治療薬用の効率的なドラッグデリバリーシステムです。その脂質層と細胞膜が融合され、カプセル内にパッケージングされてたRNAが細胞内に入り、その機能が発揮されます。さらに、LNPは治療薬を分解から保護し、バイオアベイラビリティが向上します。
LNPは、RNAベース治療薬あるいは低分子の導入など、様々なアプリケーションで使用されています。
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eGFP、F-Luciferase、またはeSpCas9を発現するmRNAをロードしたSM102、LP01、およびALC0315 LNP製剤を含む、mRNA_LNPカタログ製品をお試しください！詳細はこちら >>
当社の統合されたIVT RNA製造ワークフローは、遺伝子合成からLNPパッケージングまで最適化された合理的な製造プロセスです。
| Item | Test Method | Specification | RUO Standard QC | RUO Upgrade QC |
|---|---|---|---|---|
| Appearance | Visual Inspect | Clear and free of foreign particles | ||
| Final Concentration | RiboGreen assay | 0.1 – 0.4 mg/mL | ||
| Encapsulation Efficiency | RiboGreen assay | > 85% | ||
| Encapsulated RNA Integrity | Bioanalyzer | > 75% | ||
| Particle size | Dynamic light scattering | POI ±20 nm, 65-125mm | ||
| Poly Dispersity Index | Dynamic light scattering | < 0.2 | ||
| Zeta Potential | Zetasizer by dynamic light scattering | ± 15.0 mV | ||
| PH | pH paper | 7.4 ± 0.5 | ||
| Endotoxin | Quantitative | <4 EU/ml | ||
| Bioburden | Direct inoculation | No Growth after 48hrs |
eSpCas9 mRNAおよびTRAC sgRNAを1:1の重量比で混合し、LP01-LNP 製剤（2.4 ugのRNA/LNP）あるいはリポフェクタミンによりHEK293T細胞へ導入した。トランスフェクション後3日目および5日目に細胞を溶解し、PCRおよびサンガーシークエンシングを行った。その結果、LNPでは97%の編集効率を示したが、リポフェクタミンでは61%であった。
eGFP mRNA（100% N1-methyl-pseU 修飾、GenScript）をJurkatおよびTHP-1免疫細胞へトランスフェクションした。トランスフェクションには、SM102-LNP（GenScript）、Lipofectamine™ MessengerMAX™（ThermoFisher Scientific）およびTransIT® （Mirus）を使用し、それぞれのトランスフェクション効率を比較した。トランスフェクションは、100 ngのmRNAを用い、24ウェルプレート内で実施した。各製品のプロトコルに従い、飢餓培地（OptiMEM）をlipofectamineおよびTransITに使用し、LNPには完全培地を使用した。48時間後にeGFPの発現をフローサイトメトリーで測定した。
Fluc mRNA（100% N1-methyl-pseU修飾、GenScript）を4つの異なるLNP製剤でBalb-CマウスへIM経由、投与量0.25mg/kgの条件でin vivoでの導入効率比較した。Fluc mRNAの発現は、全身生物発光イメージングで測定した。
MC3-LNP で導入されたFluc mRNAは、マウスの背側および腹側の姿勢の両方で、8時間後および48時間後に最も高い発現レベルを示した。異なるLNP製剤の生体分布プロファイルを評価するため、マウスの心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓および脳を48時間後に回収しイメージング評価した結果、MC3-LNP製剤は他の製剤に比べ48時間後に最も強い肝臓への蓄積を示した。
Fluc mRNA（100% N1-methyl-pseU修飾、GenScript）を2つの異なるLNP製剤でBalb-cマウスへIV経由、投与量0.3 mg/kgの条件でin vivoでの導入効率を比較した。Fluc mRNAの発現は、全身生物発光イメージングで測定した。
イメージング解析で、SM102-LNP により導入されたFluc mRNAは、8時間後、および48時間後にMC3よりも高い発現効率を示した。異なるLNP製剤での生体分布プロファイルを評価するため、マウスの心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓および脳を48時間後に回収しイメージング評価した結果、SM102-LNPはMC3-LNPと比べ48時間後により強い肝臓への蓄積を示した。MC3-LNPは48時間後に、より強い脾臓への蓄積を示した。どちらの製剤も、3日間の実験期間中に、有意な体重減少を引き起こさなかった。
脂質ナノ粒子 (LNP) は、自己集合して球状構造を形成できる天然または合成の分子です。 LNP は通常、脂質層で構成されており、薬物や他の治療薬を送達するために使用できる内部コンパートメントの周囲にシェルを形成します。 LNP は、治療薬を分解から保護し、バイオアベイラビリティを向上させる能力があるため、薬物送達システムとしてますます人気が高まっています。 特定の細胞や組織を標的とするように設計することもでき、それにより正確な薬物送達が可能になります。 LNP は、mRNA ワクチンなどの RNA ベースの治療薬の送達など、さまざまな用途に使用されています。 LNP の脂質層は細胞膜と融合することができ、これによりカプセル化された RNA が細胞内に侵入して治療効果を発揮できるようになります。 LNP は、小分子やタンパク質など、他の種類の薬物の潜在的な送達システムとしても研究されています。
当社のLNPサービスでは20nt～10kntのRNAを搭載可能です。
弊社で使用可能な LNP 製剤 (MC3 / SM102/ ALC0315 または LP01) はすべて活性標的製剤ではないため、特定の組織を標的とするのではなく肝臓に蓄積する傾向があります。 ただし、臓器固有の LNP が必要な場合は、お客様のご要望に応じてカスタマイズされた製剤を提供できます。 詳細については、弊社までお気軽にお問合せください。
mRNA には SM102 および ALC0315 LNP をお勧めします。これら 2 つは、生体内での mRNA 送達において優れた効率を示しています。 初期段階の研究やプロセス検証用にマーカー遺伝子をコードするカタログ mRNA製品をLNPにパッケージングすることも可能です。
MC3-LNP は、これまでに siRNA 送達に使用されて成功しています。
はい、複数のガイド RNA と Cas9 mRNA を 1 つの LNP 製剤にパッケージング可能です。 ジェンスクリプト は、最大 160nt 長の sgRNA 合成サービスとカスタマイズされた Cas9 バリアントの mRNA 生成サービスも提供しています。
可能です。場合によっては実施できない場合もございますので、詳細は弊社までお気軽にお問合せください。
可能です。場合によっては実施できない場合もございますので、詳細は弊社までお気軽にお問合せください。
マイクロ流体デバイスとチップを使用してLNPを調製します。
最終的なカプセル化効率は >90% です。 ただし、カプセル化プロセス中に最大 50% のペイロード損失が発生すると予想されます。 たとえば、2 mg のペイロード入力では 1 mg のカプセル化が期待でき、最終的なカプセル化量の変動は ±10% です。
カプセル化には 200ug の mRNA を合成することをお勧めします。
当社が提供する標準的な濃度は 0.1 ～ 0.4 mg/ml で最高濃度は 2mg/mL です。
モデルナ社の研究結果によると、LNP ファイナルバッファーには、PBS と比較して長期安定性を可能にするトリス緩衝液を使用しています。 LNP の最終バッファーとして、スクロースを含む PBS またはスクロースを含む Tris を使用するオプションも提供しています。 スクロースは凍結防止剤として使用されます。 デフォルトのバッファーはスクロースを含む PBS です。
LNP を解凍し、解凍後は 4°C で最長 1 か月間までの保管を推奨しています。 ファイナルバッファー組成に基づいて PBS またはトリスで希釈します。
LNP を 3 か月以上保存する場合は、凍結防止剤を追加することをお勧めします。 ジェンスクリプトは、スクロースを含むデフォルトの PBSバッファーでドライアイス梱包で出荷します。 LNP は受け取り後、使用するまで -80°C で保管することをお勧めします。 凍結融解は避けてください。 使用当日に解凍することをお勧めします。それ以外の場合は、解凍した LNP の保管期間は 4°C で最長 1 か月間です。
LNP は、受け取り後-80°C で適切に保管し、凍結解凍を避けた場合、少なくとも 3 か月間は安定です。 凍結/解凍サイクルは、mRNA の長さに依存します。 1~2kb の場合は、凍結/解凍を 2 回以上行わないことをお勧めします。 2~5kb の場合、凍結/解凍は 1 回までにすることをお勧めします。 LNP を解凍する必要がある場合は、氷上で解凍し、解凍した製剤を 4°C に保つことをお勧めします。
同じプロトコールを接着細胞株と免疫細胞株にも使用できます。
