目的: 染色体Y上の、50,245 bpの長さの遺伝子(ヒト)を合成
戦略: (a) ターゲットの配列を、200 bp の重複領域を持つ 5' および 3' 末端に Ascl 制限部位を含む 10 x 5 kb のフラグメントに分割(図1);(b) 全フラグメントをpUC57ベクターにクローニングし、アセンブリのために酵母へ形質転換; (c) スクリーニング後(図2)、選択したクローンを最終的な検証のために制限酵素消化およびNGSシークエンシングを実施。
結果: 消化した遺伝子のゲル電気泳動(図3)およびNGSシークエンシング(図4)の結果、50 kbの遺伝子がエラーなく、全長で合成されていることが示された。
図1 最終的なコンストラクトとアセンブリ戦略
図2 コロニースクリーニング
図3 プラスミド(レーン1)およびSalIによる消化産物(レーン2)のゲル電気泳動結果
図4 最終検証時のNGSシークエンシング