GMP Cas9ヌクレアーゼ

無菌製造、追跡可能な文書化、厳格な品質管理を兼ねそろえたウルトラパフォーマンス

概要

CRISPRの遺伝子編集を含むアプリケーションは、基礎研究から臨床製造ステージに移行しており、高い品質の原材料と完璧な文書化が必須となっています。厳格な仕様に対応するため、GenScriptはGMPグレードのGenCRISPR™ Ultra SpCas9およびeSpCas9ヌクレアーゼ、そしてGMPグレードのsgRNA合成サービスを提供しています。

GMPグレードのGenCRISPR™ Ultra SpCas9およびeSpCas9ヌクレアーゼは、無菌製造、追跡可能な文書化、厳格な試験およびその他のGood Manufacturing Practice（GMP）のガイドラインに準拠した施設、プロセスで製造されています。GMPグレードのUltra SpCas9およびeSpCas9ヌクレアーゼは、試験済みの細胞株およびプライマリーT細胞で、高いノックアウトおよびノックイン効率でのCRISPR遺伝子編集を可能にします。

ハイライト

一貫した高い編集効率

以下において一貫した高いノックアウトおよびノックイン効率が確認されています。

試験済みの細胞株およびプライマリーT細胞

様々なエレクトロポレーションスケール

様々なグレードのUltra Cas9ヌクレアーゼ

高いロット間の均質性

以下において高いロット間の均質性が確認されています。

in vitroでの切断アッセイ

遺伝子編集アプリケーション

超高安定性

以下の条件で活性と純度の高い安定性を確認しています。

25°Cおよび4°Cでの加速試験

-20°Cでのリアルタイム安定性試験

凍結融解安定性試験

厳格な仕様

以下に関してGMP準拠下で製造

無菌製造

追跡可能な文書化

厳格な試験

CRISPR 遺伝子編集

製品リスト

All

GMP Grade [11]

Basic GMP Grade [11]

RUO Grade [11]

GMP Grade SpCas9 and eSpCas9

カタログ番号	タンパク質名前	納品量	価格	注文
Z03623-GMP	GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-GMP		-
Z03624-GMP	GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP		-

Basic GMP Grade SpCas9 and eSpCas9

カタログ番号	タンパク質名前	納品量	価格	注文
Z03623	GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-basic GMP		-
Z03624	GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-basic GMP		-

RUO Grade SpCas9 and eSpCas9

カタログ番号	タンパク質名前	納品量	価格	注文
Z03621	GenCRISPR™ Ultra NLS-Cas9-Research		-
Z03622	GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-Research		-

厳格な製造・製品化基準

製造仕様

Test
	GenCRISPR™ Ultra Cas9 and eSpCas9 Nucleases
	GMP Grade*	Basic GMP Grade**	RUO Grade
Facility	GMP Compliant	Non-GMP Compliant	Non-GMP Compliant
cGMP Guidelines	+++	++	+
ISO9001	/	/	+++
ISO13485	+++	+++	/
Quality Control	+++	+++	+
Documentation	+++	++	+

注：
*GMP GradeとはGenScript が GMP 準拠施設で製造された Cas9 ヌクレアーゼを説明するために使用する特定の用語です。現行適正製造基準 (cGMP) のガイドライン、ISO 13485 品質管理システム規格に準拠し、厳格なプロセス管理と完全な文書記録を備えています。GenScriptは、特定の地域において、お客様のプロジェクトを支援するための文書化、サイト監査、およびその他サポートを提供いたします。

** Basic GMP Gradeとは、GenScriptがISO13485品質管理システム基準、より厳密なプロセス管理、比較的完全な文書記録に従って製造された試薬を説明するために使用する、ブランディングした用語です。GenScriptは、特定の地域において、お客様のプロジェクトを支援するための文書化、サイト監査、およびその他サポートを提供いたします。

出荷基準

Test
		GenCRISPR™ Ultra Cas9 and eSpCas9 Nucleases
		GMP Grade	Basic GMP Grade	RUO Grade
Concentration		10.0 mg/mL±10%	10.0 mg/mL±10%	10.0 mg/mL±10%
Appearance		Clear, colorless	Clear, colorless	Clear, colorless
Purity	SDS-PAGE	≥ 95 %	≥ 95 %	≥ 90 %
Purity	SEC-HPLC	≥ 95 %	≥ 95 %	≥ 95 %
Activity		≥ 90 % (SpCas9) ≥ 85 % (eSpCas9)	≥ 90 % (SpCas9) ≥ 85 % (eSpCas9)	≥ 90 % (SpCas9) ≥ 85 % (eSpCas9)
Endotoxin		< 10 EU/mg	< 10 EU/mg	< 10 EU/mg
Residual DNase		≤ 10 ng/mg	≤ 10 ng/mg	Non-detectable Qualitative Method
Residual RNase		≤ 1 ng/mg	≤ 1 ng/mg	Non-detectable Qualitative Method
Residual HCP		< 10 ng/mg	< 10 ng/mg
Residual HCDNA		≤ 1 ng/mg	≤ 1 ng/mg
Mycoplasma		< LOD	< LOD
Sterility		Sterile	Sterile

事例集

Cas9 ヌクレアーゼのグレード間ノックアウト効率の均質性 (プライマリーT細胞)

図1：basic GMPおよび研究グレードGenCRISPR™ Ultra Cas9または GenCRISPR™ Ultra eSpCas9を使用し、

エレクトロポレーションによりプライマリーT細胞のTRACをノックアウト GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-Research（Cat. No. Z03621）、 GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-basic GMP（Cat. No. Z03623）、GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP （Cat. No. Z03623-GMP）または GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-Research（Cat. No. Z03622）、GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-basic GMP（Cat. No. Z03624）、GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP（Cat. No. Z03624-GMP）とsgRNA（GenScriptのCRISPRsgRNA合成サービスで作製）をエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクションし、ヒトTRAC遺伝子をノックアウトした。トランスフェクションおよび細胞培養後、TRACノックアウト効率をフローサイトメトリーで測定した。GMP、basic GMPおよび研究グレードGenCRISPR™ Ultra Cas9または GenCRISPR™ Ultra eSpCas9いずれにおいても一貫した高い遺伝子編集効率を示した。

Cell Type:	Primary T cells
Transfection Method:	Electroporation
Target Gene:	TRAC
Cell amount:	1.0 x 10⁶ cells
Cas9:sgRNA ratio:	1:2
RNP amount:	25 pmol

様々なエレクトロポレーションスケールで一貫した高い編集効率(プライマリーT細胞)

図2： GMPグレード GenCRISPR™ Ultra Cas9または GenCRISPR™ Ultra eSpCas9を、プライマリーT細胞へ様々なスケールでエレクトロポレーションし、TRACをノックアウト

GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP（Cat. No.　Z03623-GMP）、 GenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP （Cat. No.　Z03624-GMP）または他社Cas9 ヌクレアーゼと、sgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）を20 μl また100 μlのスケールでエレクトロポレーションし、トランスフェクションした。細胞培養後、TRACノックアウト効率をフローサイトメトリーで測定・解析した。本データは、GMP Grade GenCRISPR™ Ultra Cas9およびGenCRISPR™ Ultra eSpCas9は、異なるエレクトロポレーションスケールでも一貫して高い編集効率を示した。

Electroporation Scale	20 μl	100 μl
Cas9 nuclease amount	4 μg	20 μg
Cell amount	1.0 × 10⁶	5.0 × 10⁶
Cas9: sgRNA (molar ratio)	1:2	1:2
RNP amount	25 pmol	125 pmol

GMP Grade GenCRISPR™ Ultra Cas9 およびUltra eSpCas9を使用した、プライマリーT細胞における高いノックイン効率

図3：プライマリーT細胞のTRAC部位へ、GMP Grade GenCRISPR™ Ultra Cas9またはGenCRISPR™ Ultra eSpCas9を使用して、エレクトロポレーションでGFP遺伝子をノックイン

GMP Grade GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP（Cat. No. Z03623-GMP）またはGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP（Cat. No. Z03624-GMP）と、sgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）、および二本鎖DNA HDRテンプレート（GenScriptのHDRドナーテンプレート合成サービスで作製）を、エレクトロポレーションでトランスフェクションした。細胞培養後、遺伝子ノックイン効率をフローサイトメトリーで測定・解析した。GenScriptのGenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP（Cat. No. Z03623-GMP）およびGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP（Cat. No. Z03624-GMP）は、プライマリーT細胞において高い遺伝子ノックイン効率を示した。

Cell Type:	Primary T cells
Transfection Method:	Electroporation
Target Gene:	TRAC
Gene Knocked-in:	GFP
Cell amount：	1.0 x 10⁶ cells
Cas9:sgRNA ratio:	1:2
RNP amount:	25 pmol

GMP Grade GenCRISPR™ Ultra Cas9 およびUltra eSpCas9の細胞株における高いノックアウト効率

図4：GenCRISPR™ Ultra SpCas9または GenCRISPR™ Ultra eSpCas9をJurkat細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクションし、CIITA、GM-CSFおよびTGFBR2をノックアウト

Jurkat細胞に、GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP （Z03623-GMP）またはGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP（Z03624-GMP）もしくは他社の野生型Cas9タンパク質と、sgRNA（GenScriptのCRISPR sgRNA合成サービスで作製）をエレクトロポレーションでトランスフェクションし、ヒトCIITA、GM-CSF、TGFBR2遺伝子をノックアウトした。細胞培養後、遺伝子編集効率をサンガーシークエンシングで解析した。GenCRISPR™ Ultra NLS-SpCas9-GMP（Z03623-GMP）およびGenCRISPR™ Ultra eSpCas9-2NLS-GMP（Z03624-GMP）の両方で、高い遺伝子ノックアウト効率を示した。

Cell Type:	Jurkat cells
Transfection Method:	Electroporation
Target Gene:	CIITA, GM-CSF and TGFBR2
Cell amount:	0.5 x 10⁶ cells
Cas9:sgRNA ratio:	1:3
RNP amount:	7.5 pmol